pcr技术中需要添加的引物有几种

PCR引物浓度一般选5～20μmol/L。

PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即：引物(PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。

引物有多种设计方法，由PCR在实验中的目的决定，但基本原则相同。PCR所用的酶主要有两种来源：Taq和Pfu，分别来自两种不同的噬热菌。其中Taq扩增效率高但易发生错配。Pfu扩增效率弱但有纠错功能。所以实际使用时根据需要必须做不同的选择。

模板即扩增用的DNA，可以是任何来源，但有两个原则，第一纯度必须较高，第二浓度不能太高以免抑制。

缓冲液的成分最为复杂，除水外一般包括四个有效成分：缓冲体系，一般使用HEPES或MOPS缓冲体系；一价阳离子，一般采用钾离子，但在特殊情况下也可使用铵根离子；二价阳离子，即镁离子。

扩展资料

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：DNA模板-引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”。

而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

参考资料来源：百度百科-引物

PCR技术的主要步骤如下：

1、dna变性：（90℃-96℃）：在热作用下，双链dna模板的氢键断裂，行程单链dna。
2、退火：（60℃-65℃）：体系温度降低，引物与dna模板结合形成局部双链。

3、延伸：（70℃-75℃：以dntp为原料，在taq酶的作用下（72℃左右），以dntp为底物，从引物的3′端开始，从5′→3′端延伸，用模板法合成互补dna链。

每一个周期都被变性、退火和延长，使dna含量加倍。现在有些pcr即使taq酶活性不是最好的，也能在很短的时间内复制，因为扩增区域很短。

因此，可改为两步法，即在60℃-65℃同时进行退火和延伸，以减少一次升温和降温过程，提高反应速度。

底漆设计基本原则

1、引物长度：15-30bp，一般约20bp。

2、引物碱基：g+c含量为40-60%，g+c太少扩增效果不好，g+c太多易出现非特异性条带。ATGC应随机分配，以避免超过5个嘌呤或嘧啶核苷酸。

3、引物中不应有互补序列。

4、两个引物之间不应有互补序列，特别是要避免3′端的互补重叠。

5、引物与非特异扩增区的同源性不应超过70%。引物3′端的8个碱基不能在待扩增区域外有完整的互补序列，否则容易导致非特异性扩增。

6、底漆3‘端的底座，特别是最后两个底座，应严格匹配。最好的选择是G和C。

7、底漆的5’端可以改性。例如，添加限制性酶位点，引入突变位点，用生物素标记，荧光物质，地高辛，添加其他短序列，包括起始密码子、终止密码子等。

扩展资料：

pcr技术的基本原理类似于dna的自然复制过程，其特异性依赖于靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

pcr是一种体外dna扩增技术，它依赖于dna聚合酶在模板dna、引物和四种脱氧核苷酸存在下的酶促反应。待扩增的DNA片段及其两侧互补的寡核苷酸链引物通过“高温变性-低温退火-引物延伸”三步反复循环，使DNA片段的数量成倍增加，因此在短时间内，我们需要大量的特异性基因片段。

在环境检测中，靶核酸序列经常存在于细胞提取物等复杂混合物中，且含量非常低。对于检测这种复杂群体中的特定微生物或基因，杂交是不敏感的。

pcr技术可以将目标序列扩增几个数量级，然后用探针杂交检测扩增序列，用于微生物种群结构的定性或定量分析。pcr技术常与rt-pcr、竞争pcr、巢式pcr、rapd、ardra等技术结合使用。

第一代pcr是一种常用的定性pcr技术。采用普通pcr扩增靶基因，琼脂糖凝胶电泳分析产物。第二代pcr为实时pcr（qpcr）。它可以通过在反应体系中加入荧光试剂来实时监测扩增产物的积累，并用荧光曲线的cq值来量化初始目标基因的浓度。

第三代pcr技术，数字pcr（dpcr，digpcr）是一种新的核酸检测和定量方法。它可以通过直接计数目标分子而不依赖于任何校准品或外标物来确定被检测到的目标分子的绝对数量，低至单拷贝。

PCR芯片技术是PCR仪器小型化的发展趋势之一，PCR芯片就是在这一趋势下诞生的。PCR芯片是一种微型PCR仪器，用于在微载体上进行PCR反应。芯片pcr不仅节省了大量试剂，降低了实验成本，而且有助于改进。

参考资料：

百度百科-PCR技术